Angkutan kota sebagai angkutan umum yang murah dan menjangkau sebagian besar masyarakat kelas menengah kebawah masih banyak beroperasi dan diburu oleh masyarakat. Banyaknya angkutan kota yang beroperasi menimbulkan masalah tersendiri dalam hal pengaturan rute trayek angkutan kota dan pengoptimalan penggunaan bahan bakar. Pengoptimalan rute angkutan kota dapat dilakukan dengan optimasi rute angkutan kota, studi penentuan rute trayek angkutan kota Malang dengan berdasarkan pada jarak tempuh dan penumpukan (intersection) jalur antar trayek dengan mempertahankan bahwa setiap trayek harus memenuhi titik awal dan titik tujuan yang telah ditetapkan. Salah satu cara untuk menyelesaikan permasalahan optimasi tersebut yaitu dengan penerapan algoritma genetika. Pada algortima genetika terdapat 4 parameter yang mempengaruhi hasil fitness yang diperoleh yaitu jumlah populasi, probabilitas crossover, probabilitas mutasi dan jumlah generasi. Pada penelitian ini dilakukan analisa pengaruh parameter genetika terhadap nilai fitness rata – rata yang diperoleh. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perubahan parameter genetika probabilitas crossover (pc) dan jumlah generasi mempunyai pengaruh yang cukup signifikan terhadap kenaikan nilai fitness yang diperoleh, yaitu semakin besar nilai probabilitas crossover, nilai fitness mengalami kenaikan (nilai fitness tinggi) , begitu juga untuk jumlah generasi. Dan dari nilai fitness terbaik yang diperoleh pada pengujian dengan pc : 90%, pm : 30%, jumlah populasi : 30 dan jumlah generasi : 100 diperoleh hasil bahwa sebanyak 19 dari 25 trayek, memenuhi jarak tempuh yang telah ditentukan serta terdapat 95 total tumpukan jalur dari 176 tumpukan jalur pada keadaan yang sebenarnya.